Il traboccamento di formiato determina l'intrappolamento di folati tossici nelle cellule tumorali inibite da MTHFD1

Nature Metabolism volume 5, pagine 642–659 (2023) Citare questo articolo

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Le cellule tumorali alimentano la loro maggiore necessità di rifornimento di nucleotidi sovraregolando il metabolismo di un carbonio (1C), inclusi gli enzimi metilenetetraidrofolato deidrogenasi-cicloidrolasi 1 e 2 (MTHFD1 e MTHFD2). TH9619 è un potente inibitore delle attività della deidrogenasi e della cicloidrolasi sia in MTHFD1 che in MTHFD2 e uccide selettivamente le cellule tumorali. Qui, riveliamo che, nelle cellule, TH9619 prende di mira l'MTHFD2 nucleare ma non inibisce l'MTHFD2 mitocondriale. Quindi, l’eccesso di formiato dai mitocondri continua in presenza di TH9619. TH9619 inibisce l'attività di MTHFD1 che si verifica a valle del rilascio di formiato mitocondriale, portando all'accumulo di 10-formil-tetraidrofolato, che chiamiamo "trappola del folato". Ciò provoca l’esaurimento del timidilato e la morte delle cellule tumorali che esprimono MTHFD2. Questo meccanismo di intrappolamento dei folati precedentemente non caratterizzato è esacerbato dai livelli fisiologici di ipoxantina che bloccano la via di sintesi delle purine de novo e inoltre prevengono il consumo di 10-formil-tetraidrofolato per la sintesi delle purine. Il meccanismo di intrappolamento dei folati qui descritto per TH9619 differisce da altri inibitori e antifolati MTHFD1/2. Pertanto, i nostri risultati svelano un approccio per attaccare il cancro e rivelano un meccanismo di regolazione nel metabolismo 1C.

Il metabolismo di un carbonio (1C) è fondamentale per la fornitura di nucleotidi per la sintesi e la riparazione del DNA. Senza un apporto di nucleotidi sufficiente a soddisfare le richieste proliferative, le cellule vanno incontro all'arresto del ciclo cellulare o alla morte cellulare a causa dello stress di replicazione e dell'instabilità genomica1,2,3. Gli enzimi coinvolti nella via del metabolismo 1C sono comunemente sovraregolati nel cancro per produrre nucleotidi e amminoacidi necessari per una rapida proliferazione4,5,6.

Il metabolismo 1C è alimentato prevalentemente dall'amminoacido non essenziale serina, che può essere generato dall'intermedio glicolitico 3-fosfoglicerato o fornito dallo spazio extracellulare7. Il catabolismo della serina tramite il metabolismo 1C folato-dipendente è necessario per la sintesi dei nucleotidi. È mediato da quattro reazioni enzimatiche reversibili che si verificano nei mitocondri e nel citosol (Fig. 1a). La serina idrossimetil transferasi (SHMT) trasferisce un gruppo idrossimetil dalla serina al tetraidrofolato (THF) per generare 5,10-metilentetraidrofolato (CH2-THF) e glicina. La metilenetetraidrofolato deidrogenasi-cicloidrolasi (MTHFD) ossida e idrolizza CH2-THF in 10-formil-tetraidrofolato (10-CHO-THF), che viene quindi idrolizzato in THF e formiato dalla formil THF sintetasi. Nel citosol, queste reazioni sono catalizzate da SHMT1 e dal trifunzionale MTHFD1, che comprende due domini distinti, il dominio deidrogenasi-cicloidrolasi (DC) e il dominio formil THF sintetasi (FS). Nel mitocondrio, le stesse reazioni sono catalizzate da SHMT2, MTHFD2 bifunzionale (attività DC) e MTHFD1L (attività FS) (Fig. 1a)8. Sebbene esistano variazioni9, la direzionalità canonica del percorso segue il catabolismo della serina e l'ossidazione delle unità 1C attraverso il mitocondrio, mentre le unità 1C citosoliche seguono un percorso riduttivo (inverso) guidato da un elevato rapporto NADPH:NADP+ citosolico8,10,11,12. In questo modo, il metabolismo 1C forma un ciclo che si sviluppa tra mitocondrio e citoplasma. A causa della reversibilità delle reazioni catalizzate da SHMT1 e MTHFD1, la perdita del metabolismo mitocondriale 1C può essere compensata attraverso la via citosolica13.

a, flusso metabolico 1C tra mitocondri e citosol/nucleo. b-e, Curve dose-risposta di cellule SW620 trattate per 96 ore con TH9619 (b), TH9975 (c), DS18561882 (d) o SHIN1 (e) in presenza di 50 μM di timidina, 1 mM di formiato di sodio o veicolo ( coltivato in RPMI-FBS), significa ± sd (n = 3). f, tasso di rilascio di formiato derivato dalla serina [U-13C] di cellule SW620 WT, MTHFD2−/− e SHMT1−/− trattate per 24 ore con le concentrazioni indicate di TH9619 e TH9975 o 50 nM MTX (coltivate in RPMI-FBS) , significa ± sd (n = 3 per controllo e TH9619, n = 2 per TH9975, n = 1 per MTX); ANOVA (analisi della varianza) unidirezionale con il test dei confronti multipli di Tukey. g, Quantificazione del potenziale di membrana mitocondriale in cellule SW620 WT trattate con 1 µM di TH9619 o TH9975 o 0,5 µM MTX per 48 ore. FCCP è stato utilizzato come controllo positivo. I dati vengono visualizzati come medie ± sd (n = 4, n = 5 per FCCP); ANOVA unidirezionale con test di Dunnett per confronti multipli. h,i, analisi CETSA della stabilizzazione MTHFD2 in cellule SW620 WT trattate per 3 ore con 10 µM di TH9619 o veicolo. La stabilizzazione di MTHFD2 è stata valutata mediante western blot normalizzando il segnale MTHFD2 rimanente su HSP60 nelle frazioni mitocondriali (h) o lamina A/C nelle frazioni nucleari (i). j, Immunoblot rappresentativi di uno dei due esperimenti indipendenti. k, analisi DARTS della stabilizzazione di MTHFD1 in lisati SW620 che sono stati incubati con 10 µM di TH9619 o veicolo per 30 minuti, seguita da digestione delle proteine ​​all'aumento della concentrazione di pronasi e valutazione della degradazione di MTHFD1 mediante western blot. Il segnale MTHFD1 è stato normalizzato in SOD1. Viene mostrato un rappresentante di tre esperimenti indipendenti. l, valori medi di pIC50 (−log della metà della concentrazione inibente massima) per gli inibitori MTHFD1/2 indicati valutati per la loro attività inibitoria contro MTHFD1(DC) WT o mutante MTHFD1(DC) (Q100A), media (da sinistra a destra n = 4, 9, 2, 19, 5, 15, 5, 6, 4, 8); t-test non accoppiato a due code. m, la cassetta CRISPR-Select per MTHFD1-Q100A è stata consegnata alle cellule SW620. Il grafico mostra il rapporto tra MTHFD1-Q100A rispetto al WT al giorno 2 e al giorno 25 del trattamento con 10 μM TH9619 normalizzato al valore del giorno 2, medie ± sd (n = 4); t-test accoppiato a due code.